转基因动物研发现状

2013-06-26 | 作者: | 标签: 硕鼠 家蚕 果蝇


图自 scq.ubc.ca 

1982年转基因“硕鼠”的出生,掀起了利用转基因技术改善动物生产性能、抗病能力、开发乳腺生物反应器的研究浪潮,有力地推动了功能基因组学、转基因技术、体细胞核移植等前沿技术的快速进步。转基因物种涉及了猪、牛、羊、鸡、鱼、家蚕、果蝇等,涉及的性状囊括了生长、繁殖、抗病、饲料转化率、肉质、乳腺(输卵管)特异性表达药用或营养蛋白、人源化器官等,使得转基因技术或产品涉猎了生物医学、组织工程、细胞工程、特殊表型动物、濒危动物资源保藏等多个方面。
 
动物转基因技术是指运用基因工程等手段,通过转入外源DNA,对动物基因组进行遗传修饰,利用育种技术使外源DNA稳定遗传给后代的一种生物技术。
 
动物转基因技术主要是针对早期胚胎进行操作,以获得转基因个体。由于早期胚胎的脆弱性、环境条件要求的严谨性、胚胎移植过程的技术依赖性,造成了转基因动物生产的难度大、生产效率低等制约瓶颈。经过多年来世界范围内有关科学家的艰苦努力,动物转基因技术无论在技术上还是在理论上均取得了重要突破,实现了由随机整合到定点修饰、由单一基因的转移到多基因的联合转移、由组织特异性表达到条件性表达调控、由胚胎的微注射到体细胞核移植等方面的巨大进步,转基因动物生产效率明显提高,转基因方法繁多,并获得了大量的转基因动物,有些已经实现了产业化,价格超过了非转基因个体的4倍之多,充分展示了转基因动物诱人的前景。
 
1、原核期胚胎显微注射法:通过显微注射针把目的基因直接注入受精卵雄原核,使目的基因成功整合到基因组,来制作转基因动物。1982年,Palmiter等人将5’调控区缺失的大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I基因启动子相连,应用该方法制作了比普通小鼠重1.87倍的“巨型小鼠”,在生命科学领域引起了一场不小的轰动。之后,Hammer等也利用该方法成功地制作了转基兔、绵羊和注。该方法优点是基因导入可靠、用量少、无筛选标记等优点。缺点是转基因效率较低,一般为3-5%,在小鼠上却达到了10%,在绵羊的显微注射中也由原来的3%上升到10%以上,因此在各技术环节的质量控制良好,显微注射法还是有效的方法。
 
2、脂质体转染法:脂质体由脂质双分子层组成,磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜。由于脂质体的融合及内吞作用能把DNA有效地引入动物细胞中,该方法操作简便,转化效率高,可用于瞬时转染,也可用在永久表达细胞系的建立。目前主要利用脂质体对细胞系进行转染,筛选出转基因细胞后,结合核移植技术获得转基因克隆个体。但也有关于利用脂质体对早期胚胎或精原细胞进行转染获得转基因动物的报道,但数量不多。
 
3、精子载体法:将处理好的精子与外源DNA共同孵育后,通过体外受精、人工授精转染到胚胎中,最终获得转基因动物的方法。该方法操作简单,不需要很高的技术和试验条件要求,费用低廉。缺点是转基因效率低,可重复性差,尚处于探索阶段,在实践中应用较少。
 
此外,随着精子介导法在理论与实践上的发展,单精注射技术(ICSI)也成为了人们制备转基因猪的一项技术,实质上是将精子与外源基因的共注射,外源基因的整合效率较高,但对设备要求较高、操作人员的技术水平要求较严格。
 
4、逆转录病毒感染法:RNA病毒侵染宿主细胞后,可将自身的RNA反转录为相应的DNA,并整合到宿主细胞的DNA上中,这样就可将外源基因携带进宿主细胞,获得转基因动物。
 
Salter等人利用禽白血病病毒感染了早期的鸡胚成功制作了转基因鸡;另外,Haskell等人也应用该逆转录病毒感染法制作了转基因牛。这种方法的优点是感染率高、宿主范围广、外源基因为单拷贝整合、使用方便,是转基因鸡制备的首选方法,并借此制备了大量的转基因鸡。缺点是具有安全隐患、导入DNA的片段受限。
 
5、精原干细胞介导法:利用显微注射法或睾丸打点法将外源基因转染曲细精管内的精原干细胞,由精原干细胞分化产生的精子就能长期携带外源基因,与卵子结合后,可产生转基因后代。
 
6、胚胎干细胞法:胚胎干细胞(ES)是从早期胚胎的内细胞团里分离出来的、能在体外培养的一种高度未分化的细胞,将ES细胞植入动物囊胚后,可参与宿主胚胎的形成,直至达到种系嵌合,因此,可将其作为一种载体,把外源DNA导入ES细胞就可以实现由此发育而成的转基因动物。Robertson等用反转录载体感染小鼠干细胞,将整合外源DNA的干细胞植入小鼠囊胚,可得到含外源DNA的子代。该法的优点是外源基因整合率高,目前世界范围内只有小鼠干细胞的建系方法比较成熟,缺点是大家畜干细胞系不易建立。
 
7、体细胞核移植技术:该技术是先把外源基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞,组成重构胚,再把其移植到假孕母体,待其妊娠、分娩后便可得到转基因克隆动物。1997年,Wilmut等利用该技术成功获得了体细胞克隆绵羊多莉。此法具有转基因效率高、基因表达可预测等优点。
 
8、转座子介导法: 转座子是基因组中一段可移动的DNA序列,可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。利用转座子的这种特性,能够携带外源基因整合到动物基因组内。piggyBac转座子首次在杆状病毒浸染粉纹夜蛾中发现,以piggyBac转座子载体为基础,构建载体-辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑蝠果蝇和家蚕。Fadool,Sang等将mariner元件分别成功地转入了斑马鱼和鸡中,实现了种系传递。Dupuy等利用SB(睡美人)转座子将外源基因转入小鼠的单细胞胚胎,外源基因可随生殖细胞传递给后代。
 
9、基因打靶技术:基因打靶技术可使外源DNA定点整合到靶细胞的特定基因座位上,对动物基因组进行精确的修饰改造。该方法的基因位点专一性强,打靶的基因片段可与染色体DNA共同稳定遗传。McCreath等在成纤维细胞中进行基因打靶,利用体细胞核移植生产出了基因打靶绵羊。Kuroiwa等通过敲除牛朊蛋白基因生产了无疯牛病的牛。
 
资料来源:
 
农业部农业转基因生物安全管理办公室等,《转基因30年实践》,中国农业科学技术出版社,2012
 

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