转基因猪研究进展

2015-04-08 | 作者: 吴梦 刘作华 林保忠 兰国成 邹贤刚 葛良鹏 | 标签: 转基因猪

由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类比较近似,因此不仅是重要的经济动物,也是生物医学研究常用的大型模式动物。而利用转基因技术,可以将人工分离或改造过的基因整合到猪的基因组中,并能稳定的遗传给后代。可以使猪的某些性状向人类需要的目标发生转变,如:增强生长性能,改善肉质结构,使之更适宜用于药物评价、疾病模型研究、特异性药物生产以及组织器官移植的供体等,因此转基因猪在畜牧学和医学生物学上具有十分重要的地位和作用。文章就国内外转基因猪研究进展、使用的技术方法及应用现状进行简要的综述。

1猪的功能基因组研究

猪共有38条染色体,其中包含18对常染色体及X、Y性染色体。研究表明,猪的全基因组包含约30亿个碱基对,和人类的基因组大小接近,并且与人类基因组有众多的保守同源区域。近年来,由于猪的经济重要性和医学研究价值,科学家们对猪基因组研究也有着极大的热情,由伊利诺大学、荷兰瓦格宁根大学和爱丁堡大学的研究人员领导的国际猪基因组测序联盟对家猪和野猪开展了最为全面的一次基因组研究,揭示了猪和人类之间一些新的、意想不到的、潜在有利的相似之处,以及一些明显的差异,该研究也被Nature杂志收录为封面文章。在掌握猪全基因组的情况下,猪的功能基因组研究便能更有效地了解猪转录组的生理复杂性。在经济效益方面,PRLR、RBP4、ESR基因已被证明与产仔数显著相关,MC4R基因与生长显著相关,PRKAG3基因与肉质显著相关,FUT1、SLA、NRAMP基因与抗病性状显著相关,KIT、MC1R基因与肤色显著相关,IGF2基因与肌肉生长显著相关。在动物模型方面,MC1R基因与诱发黑色素瘤显著相关,PARK2和PINK1基因与帕金森综合征显著相关,GGTA1基因与免疫排斥显著相关,内源性PPARγ基因与糖尿病和心血管疾病显著相关。因此,开展转基因猪研究具有重要的现实意义。

2转基因猪的研究概况

1985年,Hammer等用显微注射技术把人生长激素融合基因(MT/hGH)注射入猪受精卵中,然后将受精卵移植入发情母猪,获得了世界上第一头转基因猪。1989年,Prather等以体内来源的MI期猪卵母细胞为受体胞质,以猪四细胞期胚胎卵裂球作为供体核进行移植,共移植88枚核移植胚胎到发情母猪,最后获得了一头克隆猪。2001年,Golovan等将植酸酶转入了约克猪的唾液腺中,成功获得了植酸酶转基因猪。这种转基因猪能自行生成肌醇六磷酸酶,使得粪便中磷的含量大大降低,有效减少了对环境的磷污染。202年,Lai等将绿色荧光蛋白(EGFP)基因转入胎儿成纤维细胞中,并通过体细胞核移植的方法,成功获得了EGFP转基因猪。2005年,Webster等利用精子介导基因转移法,共转入了三种荧光蛋白基因,最后获得了18头表达荧光蛋白的转基因猪,其中三种荧光蛋白都表达的占了45%。206年Hao等同样通过体细胞核移植的方法,成功获得了2头带有eNOS(内皮型一氧化氮合酶)基因的转基因克隆猪,为人们研究在肌肉代谢和心肺系统中eNOS的功能提供了很好的实验模型。同年,Kurome等利用ICSI(猪单精子显微注射)方法,把精子与携带有人白蛋白(hALB)基因和EGFP基因的DNA序列片断共孵化,通过胚胎移植手术,成功培育了一头含有hALB和EGFP基因的转基因猪。209年,Ramsondar等通过RNAi技术的方法,获得了敲除猪内源性逆转录病毒(PERV)的转基因猪,消除了在异种器官移植时PERV感染人的危险。201年,Sommer等通过原核注射和体细胞核移植的方法,获得了ELOVL4基因的转基因猪,这些转基因猪为人们研究视网膜黄斑变性和STGD-3(III型斯塔加特样黄斑变性)的发病机理提供独特的动物模型。2013年,Miles等构建了一个标记20S蛋白酶体的核心亚基α-1型(PSMA1)的EGFP,PSMA1-EGFP与功能性精子蛋白酶成功融合,再通过体外受精的方法,最后获得了携带绿色荧光蛋白酶的转基因猪。

在国内,1992年,魏庆信等以湖北白猪为实验材料,采用显微注射和猪精子做载体两种方法导入OMT/PGH基因,获得了首批转生长激素的转基因猪。1997年,赵浩斌等以湖北白猪为受体,杜洛克为供体进行了猪卵核移植的研究,核移植后的重组胚移入受体后,经体内发育得到了5只核移植仔猪。203年,郑新民等采用显微注射法,把含有猪血清白蛋白侧翼序列的微小人血清白蛋白基因导入猪的基因组中,生产出转人血清白蛋白(HSA)的基因猪。2008年,刘忠华等对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以EGFP基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,通过胚胎移植手术的方法,成功获得了我国首例EGFP转基因克隆猪。209年,王铁东等通过RNAi技术和转基因猪制备技术相结合,培育出了稳定表达针对猪瘟病毒的shRNA的转基因克隆猪。2011年,中国科学院广州生物医药与健康研究院在国际上首次获得能够同时表达四种荧光蛋白的转基因克隆猪。2012年,叶雷等以版纳微型猪近交系成年母猪为材料,采用冷胰酶消化法获得成年猪成纤维细胞后,以其作为核移植供体细胞,移植了重构胚的3头代孕母猪均妊娠,并且有1头母猪产下1头正常的克隆猪。2013年,樊娜娜等将DOX诱导型慢病毒载体系统诱导的猪诱导性多能干细胞(piPSCs),在体外进行自发分化培养,待外源基因基本沉默后进行核移植成功获得了首例piPSC克隆猪。目前,国内在北京,上海,广东,吉林,重庆,山东,云南,湖北等省市都开展了转基因猪相关的研究。

3转基因猪的制备方法

3.1显微注射法

显微注射法(microinjection)是在倒置显微镜下用精细的显微注射针将外源基因直接注入受精卵的雄原核中,利用受精卵繁殖中DNA的复制过程,将外源基因随机整合到受精卵的染色体中,然后将注射后的受精卵经胚胎移植手术移植到发情母猪输卵管中,最后得到转基因后代。自显微注射法诞生以来,一直是制作转基因动物最简单可靠的方法,也是最常用方法。其优点是方法简单,导入的基因片段大,长度可达100kb。但其不足之处是基因整体进入染色体是随机的,得到的转基因后代效率较低。

3.2病毒载体转染法

逆转录病毒载体转染法(retrovirus-mediatedgenetransfer)是利用RNA病毒感染宿主细胞后,以其RNA为模板可反转录为相应的DNA,合成的DNA整合入宿主细胞基因组上,并能够长期稳定的表达。据此,可以用目的基因代替病毒基因,然后携带有目的基因的病毒转染宿主细胞,最后获得转基因动物。该方法的优点是比原核显微注射法效率提高了近50倍,且已经有了商业化的产品,简化了通过逆转录病毒载体转染法制备转基因动物的流程。但逆转录病毒载体转染法也有缺陷,逆转录病毒载体的容量较小,只能容纳7kb以下的外源基因。外源随机整合,有插入突变、激活癌基因的潜在危险。2003年,Hofman等利用慢病毒载体LV-PGK将EGFP基因转入猪受精卵中,成功制备了EGFP转基因猪。2009年,Ramsondar等利用逆转录病毒载体法将anti-gagand-polshRNAs基因导入猪基因组中,成功获得了表达小干扰RNA的转基因猪。2012年,Zhang等通过缺陷型慢病毒载体携带外源基因与精子共同孵育,成功培育了6头转基因猪。

3.3精子载体法

精子载体法(spermmediatedgenetransfer)是指将目的基因与精子的混合溶液,在一定的温度条件下,共同孵育一定的时间,使精子携带有目的基因,然后进行人工授精,当精子与卵子结合时,外源基因进入受精卵,这样便将目的基因导入,获得转基因动物。此方法的优点在于利用精子俘获目的基因的能力,避免了因机械操作对胚胎造成的损伤,且简单、易行,无需昂贵的显微操作仪及复杂的操作过程。但精子载体法存在可重复性差,结果不稳定,无法实现对基因组的定点修饰,存在随机整合的缺陷等缺点。2006年,Kurome等将携带有绿色荧光蛋白和人白蛋白基因序列的DNA片段与精子共同孵育,通过ICSC的方法成功培育出了表达EGFP和人白蛋白的转基因猪。2012年,刘剑飞等利用精子介导纳米基因载体法成功获得了7生长激素转基因猪。该方法采用纳米磁性液体材料将目的基因包裹,利用精子作为载体,将外源目的基因导入受体动物体内,并实现外源基因的表达。

3.4体细胞核移植法

体细胞核移植法(somaticcellnucleartransplantation)是把目的基因与供体细胞在一定条件下进行融合,使目的基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞核移植到去核卵母细胞中,经过电融合,组成重构胚胎,再通过胚胎移植术把重构胚胎移植到发情母猪输卵管中,最后得到转基因克隆动物。该方法的优点在于能够在细胞水平对基因组进行特定的改造,鉴定供体细胞与外源基因是否融合并筛选出阳性克隆,由此可以确保得到个体10%为转基因动物,且不存在嵌合体问题,提高了制备转基因动物的效率。目前没有获得胚胎干细胞系的大动物的基因改造主要是通过体细胞核移植的方法来实现。其缺点是体细胞核移植克隆的效率不高,需要大量的卵母细胞和受体动物。2003年,赖良学等利用胎儿成纤维细胞作为供体,通过核移植的方法,成功获得了转基因克隆猪。2009年,潘登科等将sFat-1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,然后以转基因细胞为核供体,体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,再将胚胎移植到受体母猪输卵管内,成功制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪。2010年,Ahn等运用核移植的方法,将人的补体调节蛋白CD59转入猪原始生殖细胞中,成功获得了表达hCD59的转基因猪。2013年,鲁月等将外源基因导入到五指山小型猪耳成纤维细胞中,利用体细胞核移植技术构建重构胚,再将重构胚移植到代孕母猪体内,成功获得了转单体红色荧光蛋白的转基因猪。

3.5徒手克隆技术

徒手克隆技术(handmadecloningtechnology)该技术最早起源于丹麦,在进行牛胚胎细胞克隆时建立的。是一项不需要利用显微操作系统进行核移植的克隆技术。其主要的技术路线包括卵母细胞去透明带,徒手切割半卵法去核,双半卵融合、激活,以及支持无透明带卵/胚胎培养技术。Vajta等进一步改进了此方法,并利用该技术成功克隆出了7只阿兹海默症的转基因猪。2007年,深圳华大基因的杜玉涛等运用徒手克隆技术成功制备了克隆猪,并将徒手克隆技术与传统的克隆技术进行比较,最后得出徒手克隆技术获得的克隆猪后代可能比传统的克隆猪后代更为健康。

3.6转座子介导的基因转移法

转座子介导的基因转移法(transposonmediatedgenetransfer)是利用转座子可以在基因组内插入和剪切的特性,使之可以携带多个外源基因整合到动物基因组内,从而制备转基因动物。该方法易于模拟内源性基因的表达,容易确定整合部位,是生物基因功能分析的有效途径。近年来,利用转座子介导的基因转移法制备转基因动物得到迅速的发展,其中以SlepingBeauty(SB)转座子和PigyBac(PB)转座子为代表。208年,刘忠华等利用转座子介导EGFP在猪体细胞中表达,通过体细胞核移植技术培育出了首例EGFP转基因克隆猪。2011年,Garels等利用SB转座子系统,将SB100X基因通过胞质注射的方法整合到猪胚胎基因组中,成功获得了表达SB100X的转基因猪。3.7ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9基因编辑技术基因定点修饰技术的发展历程大体经历同源重组,ZFN(zincfingerendonuclease,ZFN),TALEN(transcriptionactivator-likeefectornuclease)和CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas(CRISPR-associated)9四个不同阶段,由于早期仅基于同源重组的基因定点修饰技术效率很低,其应用受到很大限制。ZFN作为第一代人工核酸内切酶,它是由锌指蛋白和核酸内切酶FokI融合而成,利用它可以在各种复杂基因组的特定位置进行DNA双链切割。目前,在黑长尾猴、猪、牛、小鼠、大鼠、中国仓鼠、斑马鱼、海胆、果蝇、家蚕、烟草、拟南芥、玉米,ZFN已经广泛应用于靶向基因的突变。208年,Meng等利用ZFN介导的基因敲除技术,成功得到了slc25a5、kdrl和ntl突变体的基因。2010年,Watanabe等用ZFN技术将EGFP基因成功转入猪胎儿成纤维细胞中,并成功得到了转EGFP基因的克隆猪。但是,因为ZFN的制备工艺复杂,毒性大、脱靶严重,且成本相对昂贵,所以很快被第二代人工核酸酶(TALEN)所代替。TALEN技术是由TAL效应因子与FokI核酸内切酶相连接,形成具有编辑特异性基因组功能的强大工具。TALEN和ZFN技术都能对复杂的基因组进行精细的修饰,但前者特异性更高,构建更为简单,因此,自2010年首次报道TALEN技术在酵母中应用成功后,迅速在植物、斑马鱼、小鼠、猪、牛以及人类细胞中得到应用。2013,Xin等利用TALEN技术成功实现了猪GGTA-1基因的定点敲除,2014年,Li等还运用TALEN技术成功将猪Rosa26基因位点进行定点敲入。2013年初,CRISPR/Cas9技术作为一种最新的基因组编辑工具横空出世,其主要特点是成本低、制作简单、作用高效。它用一段序列特异性向导RNA分子(sequence-specificguideRNA)引导核酸内切酶到具体靶点,从而对特定基因位点进行切割导致突变,完成基因组的编辑。2014年10月,赖良学教授的研究团队利用CRISPR/Cas9技术成功获得酪氨酸酶基因敲除猪和PARK2和PINK1双基因敲除猪,为人们研究人类白化病和帕金森综合征提供了良好的动物模型。所以,CRISPR/Cas9的出现将为更快捷、高效的构建基因定点修饰技术提供一个崭新的平台。

4转基因猪的应用

4.1动物基因工程育种


动物基因工程育种(animalgeneticengineering)是通过现代转基因技术,将外源基因导入动物基因组,组成一个新的基因,使其在动物体内整合、表达,培育出新的遗传特性的转基因动物。其优点在于能很快培育出常规方法难以育成或不能育成的动物品种,同时解决了物种间杂交不育的生殖隔离,使选择效率提高,加快动物改良进程,所以具有很大的研究价值。目前动物基因工程育种主要包括提高动物生产性能、改良动物经济性状等方面。204年,Saeki等将菠菜根部中的FADZ基因导入猪的基因组中,成功培育出不饱和脂肪酸含量高的FADZ基因转基因猪,其体内的不饱和脂肪酸要比一般的猪高20%,从而提高了猪肉的质量。206年,Lai等把秀丽线虫的FAT-1基因导入猪的基因组,通过体细胞克隆技术培育出了富含ω-3脂肪酸的转基因克隆猪,其体内ω-6/ω-3的比值显著低于野生型体内ω-6/ω-3的比值,这将会极大地改善人们日常膳食的营养结构,促进饮食健康。2008年,娄颜坤等通过RNA干涉的方法,有效抑制肌肉生长抑制素(myostatin)基因的表达,获得了敲除myostatin基因的克隆猪。该方法为遗传育种提供了一种新技术,能够在对家畜经济性状的改良中发挥重要作用。

4.2动物生物反应器

动物生物反应器(Animalbioreactors)是利用转基因活体动物,高效表达某种外源蛋白的器官或组织,进行工业化生产功能蛋白的技术。目前,世界上已有美国、英国、荷兰等几十家公司利用转基因动物生物反应器生产医用蛋白,如hFVI、抗凝血酶I、β-乳球蛋白、红细胞生成素等。206年,Park等利用鼠源WAP启动子启动hEPO染色体结构,然后通过显微注射的方法成功获得高表达hEPO(900IU/mL)的转基因猪。209年,美国GTCBiotherapeutics公司利用山羊乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶I(商品名:ATryn)获得美国FDA批准上市,该药可以阻止遗传性抗凝血酶缺陷症患者体内形成过多血栓。2010年,荷兰Pharming公司利用转基因兔生产的单克隆抗体药物Ruconest获得欧洲药监局批准上市,该药可用于治疗遗传性血管水肿的转基因动物生产药物。这些药物的相继上市,标志着利用动物生物反应器生产的转基因药物真正迈入了商业化、产业化时代。

4.3人类疾病动物模型

2010年,Yang等利用体细胞转基因技术与体细胞核移植技术,与李晓江研究团队构建亨廷顿蛋白转基因载体密切合作,成功获得6头亨廷顿舞蹈症转基因猪。同时首次在转基因猪大脑中发现与人类亨廷顿舞蹈症患者脑中类似的神经细胞凋亡现象,这在亨廷顿舞蹈症的动物模型中还是第一次见到。该研究成果对于亨廷顿舞蹈症病理发生机制的研究以及治疗药物开发具有重要的意义。同年,陈立梅等通过体细胞核移植技术成功获得了13头Mxl-Cre转基因猪,该研究为利用Cre/loxP系统研究人类疾病发病机制奠定基础。对建立人类重大疾病的基因修饰猪动物模型,了解基因功能、阐明相关疾病发病机理、寻找疾病早期分子标志、研究新的治疗方法、验证新的药物靶标和开发新药具有重要意义。2013年,纪元等建立了Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系,随后经核移植、胚胎移植,最终获得3只Lp-PLA2转基因猪,为研究Lp-PLA2调节动脉粥样硬化发生和发展的机制打下基础。有利于为开发治疗动脉样硬化药物提供新的模型,同时有望在动脉粥样硬化发生机制上取得新突破。

4.4异种器官移植供体

由于猪的器官在形状、体积以及遗传物质与人相似,并且猪生长和繁殖迅速,不存在伦理限制,是理想的器官移植供体。异种移植目前主要面临的免疫排斥问题,而利用转基因技术进行遗传改造有望改善这一问题。1995年,Cozzi等将人的衰退加速因子、补体抑制因子转移至猪的胚胎中,成功获得27头不同程度表达了hDAF的转基因猪,这些转基因猪在可以解决器官移植中的超敏排斥反应。基因敲除猪的诞生使科学家们更加坚定了用猪作为器官移植供体的信心。2005年,Ramirez等将多基因(hDAF、CD59、α1,2-岩藻糖基转移酶)表达的猪肝脏移植到狒狒体内,手术后并未出现急性排斥反应。2011年,法国的科研小组将表达hCD5、hCD59、hCD39以及岩藻糖基转移酶的GalT-KO转基因猪的肾脏移植到狒狒体内,结果移植了肾脏的狒狒存活了2周。

5展望

随着生物技术和生命科学的迅猛发展,转基因动物的生产及相关产品已显示出了广阔的应用前景与重大的经济价值,例如运用转基因技术不仅可以对猪的品种进行改良,加快基因工程育种进程,并且可以实现跨物种间基因的定向转移。但作为刚刚起步的生物高新技术,转基因动物的研究仍处于发展阶段,还存在这样那样的问题,比如外源基因的导入存在转化率低、整合效率差,获得的转基因猪数量少且常有畸形等缺点。总之,转基因动物的研究是一项复杂的系统工程,是多学科交叉综合的新技术,我们相信,随着相关理论与技术的进一步完善结合和发展,将会为转基因动物的产业化和商业化铺平道路,大力推动相关产业的发展。原文链接:http://159.226.100.150:8082/biotech/CN/abstract/abstract16533.shtml

来源:中国生物工程杂志

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