蛋白质组学方法评估转基因抗虫玉米非预期效应

2017-11-09 | 作者: 郝文媛 李飞武 闫伟 李葱葱 郝东云 郭长虹 | 标签: 转基因抗虫玉米

摘要:
【目的】转基因育种是将对人类有益的外源基因通过生物技术整合进受体植物的基因组中,使其获得通过自然进化无法获得优异性状,这是转入外源基因的“预期效应”。然而,外源基因插入受体植物还可能产生无法控制和预期的细胞、代谢或表型等方面的改变,即“非预期效应”。非预期效应是转基因植物安全评价的核心内容之一,也是近年来研究的热点和难点。本研究以抗虫转基因玉米为材料,利用差异蛋白质组学技术比较研究转基因玉米与其非转基因玉米之间的非预期效应,为蛋白质组学技术解析转基因植物非预期效应提供理论参考。

【方法】选取 4 份已经进入中国农业部安全评价阶段转苏云芽孢杆菌( Bacillus thuringeinsis ,Bt)内毒素基因的抗虫玉米材料,即 SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd,以及它们的对照玉米材料郑单 958 和郑 58,分别种植于可控人工温室中。待玉米幼苗生长至 5 叶 1 心期时,每份材料取长势一致的 6 个单株最上部完全展开叶片,混合作为一个样本进行取样,并提取叶片蛋白质。双向电泳技术分别分离 4 种转基因玉米和它们各自对应的非转基因材料高丰度蛋白质组,利用 Image Scanner 扫描仪扫描脱色后的蛋白质凝胶,PD Quest 8.0 软件(Biorad,USA)分析蛋白质凝胶图谱,以蛋白点相对体积(% Vol)来表述每一个匹配蛋白质的表达丰度,将电泳凝胶上特异性蛋白质和相对体积大于 2 倍的差异蛋白质点取样,依据相应蛋白质数据库进行质谱鉴定,并对鉴定出的特异性和差异性蛋白质进行细胞功能富集分析(GO)和代谢途径富集分析(KEGG),以评价转基因抗虫玉米的可能非预期效应。

【结果】通过比较 4 种不同转基因抗虫玉米及其非转基因对照的高丰度蛋白质组,除目标抗虫基因外,共鉴定出 61 个蛋白质,其功能主要是富集于光合作用、碳固定、能量转运等基础细胞功能相关酶类,如核酮糖二磷酸羧化酶、ATP 合成酶、丙酮酸磷酸双激酶等。仅有少数几个与光合作用、碳固定和 ATP 合成途径等基础代谢过程相关基因出现上调表达。KEGG 分析表明,与对照 ZD958 相比,SK12-5zd 的差异蛋白在光合生物碳固定途径中显著富集;Bt799zd 的差异蛋白则分别在光合生物碳固定途径、光合作用和碳代谢途径中显著富集。与对照 Z58相比,IE034z 和 Bt799z 的差异蛋白均在光合作用代谢途径中显著富集。证明 4 种转基因材料与对照蛋白质组相似性较高,未见基因的异常表达。

【结论】测试的 4 种转基因材料在蛋白质水平未发生影响其安全性的非预期效应;当前结果表明蛋白质组学技术可以用来验证转基因植物的非预期效应。



引言:
【研究意义】植物转基因技术的目标是将有利于植物自身或满足人类需求的特定外源基因整合进入受体植物基因组中,使其获得外源基因所表现的特定性状并能够稳定遗传。这些性状就是转基因植物的目标性状,也称为预期效应。由于外源基因整合位点不确定,加之外源基因产物本身也可能使受体植物的能量代谢和物质代谢发生变化,从而影响其固有的生理代谢过程,乃至改变受体植物的固有性状。这些性状改变均是转基因育种设计过程中无法控制和预期的,这 些无法控制和预期的性状改变均称为非预期效应。 可见,转基因植物实际上是外源基因发挥预期的目标效应和受体植物基因组因外源基因的导入,而产生的非预期效应的综合体。转基因植物是否会产生非预期效应,以及对非预期效应的安全性评估一直是科学家和公众对转基因植物广泛关注的话题。长期以来,各国相关部门都是基于 1993 年欧洲经济发展与合作组织 OECD(Organization for Economic Co-operation and Development)提出的“实质等同性原则”对转基因植物进行安全性评价的,评价的核心是比较转基因植物与其非转基因受体植物间在农艺性状、环境适应性、营养及物质组成变化等的差异,以确认或排除转基因植物是否存在非预期效应。传统的检测方法不仅难以全面涵盖转基因植物可能出现的非预期效应,且检测指标有限、检测费用高、费时、费力。因此,建立全面、快速、准确、灵敏的检测技术是分析鉴定转基因生物安全性的关键所在。

【前人研究进展】近年来,蛋白质组分析技术迅速发展,双向电泳技术、iTRAQ技术等已成为当今蛋白质组学研究的核心技术 。研究人员已经在转基因玉米、水稻、大豆等材料中,对蛋白质组水平上的非预期效应的进行了评估,取得了较好的效果 。转基因玉米商业化生产以来,已占全球转基因作物种植总面积的 30%,居转基因作物的第二位,涉及的农艺性状主要为玉米螟抗性,转入的基因为种类繁多的来自苏云芽孢杆菌(Bacillusthuringeinsis,Bt)的昆虫内毒素基因(本文统称“Bt 基因”)。COLL 等利用 2D 凝胶电泳、质谱技术分析比较,发现在同一地块种植的 2 种转 Bt 基因玉米 MON810 与其对照株系的籽粒蛋白质组几乎一致,只有几个蛋白质点有 1—1.8 倍的变化,结果表明,转基因玉米 MON810 与其对照非转基因材料具有实质等同性;ALBO 等也发现 MON810 与其非转基因对照的籽粒蛋白质组之间非预期差异基本等同;ZOLLA 等发现同一田间生长的 MON810 及其对照同一品系的不同世代材料的蛋白质组存在显著差异,且在蛋白质组学水平上,环境因素对非预期变异效应的贡献比转基因插入更大。上述研究结果表明,蛋白质组学技术已逐渐成为检测转基因作物非预期效应的有效方法。

【本研究切入点】不同转 Bt 基因的抗虫玉米材料不但在目标基因上明显不同,而且由于受体材料差异和回交转育过程的不同,造成了最终的抗虫转基因玉米材料间存在着巨大的差异。这些遗传背景上的差异是否会产生非预期效应仍研究甚少,目前的研究还主要集中在 Bt 基因的抗虫目标预期效应上。转基因抗虫玉米 SK12-5、IE034、Bt799z 和Bt799zd 是中国自主研发的具有潜在产业化前景的转基因新材料,围绕上述新材料已开展了大量育种研发工作及所获相应育种材料的环境安全和食用安全评价研究,但是,对这些材料的非预期效应研究未见报道。

【拟解决的关键问题】
利用双向电泳技术对上述转基因抗虫玉米的 4 种不同遗传背景材料的转基因材料进行了比较分析,一方面在蛋白质组水平比较不同转基因材料的差异;另一方面从组学的水平初步评估了实验材料蛋白水平上是否发生了影响转基因材料安全性的非预期效应,为非预期效应评价提供数据支撑。



1.1 材料

供试材料:编号1#为具有转cry1Ab/cry2Aj并有ZD958遗传背景的杂交种SK12-5zd,由浙江大学提供。编号2#为转 cry1Ie 并有Z58遗传背景的自交系IE034z,由中国农业科学院提供。编号3#为转mcry1Ac并有Z58遗传背景的自交系Bt799z,编号4#为转mcry1Ac并有ZD958遗传背景的杂交种Bt799zd,均由中国农业大学提供。选取非转基因的自交系 Z58 和杂交种ZD958作为对照材料,编号分别为5#和6#。编号2#和3#的转基因自交系是目标遗传转化体经2代自交后,再与Z58材料进行6代回交转育后获得了具有纯合、稳定遗传背景的转基因自交系。 上述转基因材料均已采用国家发布的转基因检测标准进行了外源基因分子特征鉴定,证明均为独立转化事件,并已进入环境释放以上的转基因安全评价试验阶段。

2014年6月,将试验材料种植在吉林省公主岭市 的吉林省农业科学院的人工温室中,幼苗长至5叶1心期进行取样,每种试验材料取长势基本一致的 6个单株的最上部完全展开叶片,混合作为一个样本。液氮冷冻后,迅速放入干冰中运输至实验室,-80℃保存。

1.2 玉米叶片总蛋白提取

将叶片去主脉后剪成1cm的小段,称取0.5 g叶片加入50 mg PVPP 进行充分研磨;加入7.5 mL经 -20℃预冷的蛋白提取缓冲液Ⅰ,冰浴研磨 5 min,转入预冷的 10 mL 离心管中,-20℃放置1 h;4℃,13 000 r/min 离心45 min,弃上清;加入7.5 mL经-20℃预冷的蛋白质提取液Ⅱ,悬浮振荡,-20℃放置 1 h;4℃, 13 000 r/min 离心 45 min,弃上清,重复 2 次;加入 7.5 mL 80%预冷的丙酮,充分悬浮后,离心去上清; 沉淀真空干燥并称重。每种材料各重复 3 次,获得的蛋白用 Bradford 法[26]测定浓度后准备进行蛋白质双向电泳分析。

1.3 蛋白质等点聚焦

采用长度 24 cm,pH 3—10 的线性干胶条(Biorad, 美国),取蛋白提取液与水化缓冲液(8 mol•L-1 Urea、 2 mol•L-1硫脲、4% CHAPS、0.002%溴酚蓝,用前加入 65 mmol•L-1 DTT 和 0.2% IPG Buffer)混合至总体积 450 μL(含蛋白质约为 1 200 μg),采用被动水化 的方法处理 18 h。将水化后的胶条转移到等电聚焦槽 上(胶条酸性端置聚焦盘的“+”端,碱性端置聚焦 盘“-”端)。每根胶条加入 3 mL 矿物油,将润湿的滤纸 1/3 处放在胶条的两端夹上电极夹,扣紧聚焦盘, 等点聚焦程序和参数设置参照 Biorad 产品说明书。等点聚焦结束后,将胶条置于平衡缓冲液(6 mol•L-1 Urea、75 mmol•L-1 Tris-HCl(pH 8.8)、2% SDS、25% 甘油、0.002%溴酚蓝)振荡平衡 2 次,每次 15 min。 第一次平衡在缓冲液中加入 1% DDT;第二次平衡在 缓冲液加入 2.5%碘乙酰胺(IAM)。平衡完毕后取出 胶条轻轻用平衡缓冲液润洗,然后去除多余的平衡缓冲液,准备 SDS-PAGE 电泳。

1.4 SDS-PAGE

将平衡好的胶条置于第二向凝胶上方,排除气泡使二者紧密接触,用 1%琼脂糖凝胶封固胶条,接通电源。第一阶段 1 W/gel 运行 1 h;第二阶段 13 W/gel 运行直至溴酚蓝到达凝胶底端。双向电泳结束后, SDS-PAGE 凝胶置于固定液(10%冰醋酸、40%甲醇、 50%超纯水)中固定 3 h;凝胶固定后,超纯水冲洗 3 次,每次 15 min;加入考马斯亮蓝染色液染色(0.12%G-250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%甲醇)振荡过夜; 超纯水脱色至背景满意为止。

1.5 质谱鉴定与数据库分析

Image Scanner 扫描仪扫描脱色后的凝胶,用 Biorad PDQuest 8.0 软件分析不同玉米叶片材料的凝胶图谱,采用 YANG 等的方法,使用蛋白相对表达 体积(% Vol)来表述每一个匹配蛋白质点的表达丰度。差异蛋白质的表达丰度分析分别以 Z58 和 ZD958 材料的凝胶作为参考胶,只有蛋白质点在至少 2 个重复内被发现才被认为是真实的蛋白质点。定义平均相对表达丰度上调(出现)或下调(消失)差异大于2倍(ratio>2),并且在统计学 T 检验上 P<0.05的蛋白质为差异蛋白质点。差异蛋白质点使用液质联用质谱仪 LC-Q-TOF-MS 6520(Agilent Technologies,USA) 进行分析。使用 NCBI 玉米数据库(NCBI,Taxonomy: Zea mays,Entry:212235,2015/01/20)对蛋白质进行检索。蛋白检索结果的显著性判别标准:一般认为 PMF(Peptide Mass Fingerprinting,肽指纹图谱)在MS/MS 检索中离子分数≥88 分说明该蛋白的鉴定结 果有效,其他一些辅助标准包括至少 10%的序列覆盖率以及需要有 3 个肽段的匹配。

1.6 GO 和 KEGG 分析

采用 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)方法对质谱鉴定出的特异性蛋白(E value≤10−5 )与 NCBI non-redundant(Nr)蛋白质数据库进行比较,确定相应的蛋白质并获得对应的基因信息,用DAVID方法对这些表达有差异的基因进行基因功能注释(gene ontology,GO)分析,对差异蛋白功能及代谢途径进行 KEGG 通路分析。

2 结果

2.1 差异表达蛋白的分离及鉴定

为了比较不同转基因抗虫玉米蛋白质组差异,对供试材料的叶片总蛋白进行了双向电泳分析。结果显示,各受试材料均可检测到超过1200个清晰蛋白点 。

将电泳胶图扫描后使用 Biorad PDQuest8.0 软件对每个转基因材料及其对照(1#和 6#、4#和 6#、2# 和 5#、3#和 5#)进行比较,对电泳凝胶上相对表达体积超过 2 倍的差异蛋白质点进行质谱仪分析,成功鉴定玉米基因组蛋白 61 个(表 1)。进一步分析特异蛋白点(只在转基因与对照的一个材料中出现) 和差异蛋白点发现,这些蛋白点中核酮糖二磷酸羧化酶相关蛋白点 15 个,ATP合酶类蛋白点 4 个,放氧 增强蛋白点 13 个,丙酮酸磷酸双激酶相关蛋白点 3 个,GADPH 酶相关蛋白点 2 个,类萌发素蛋白相关蛋白点 4 个,草铵膦乙酰转移酶相关蛋白点 2 个(3#和 4#),其他蛋白点6个,未知功能蛋白点 10 个。 这些蛋白所涉及的生化反应过程主要集中在光合作用、碳固定和能量代谢等方面。根据不同蛋白的功能以及质谱检测结果,对各类蛋白在不同转基因材料中变化的趋势进行了汇总分析(表 2)。结果显示,在4种转基因玉米材料中发现被认为参与植物对逆境胁迫响应的类萌发素类蛋白均有显著的表达升高;而只有质体蓝素钠一类蛋白在 4#材料中发生了表达显著降低;涉及光合作用及碳固定的相关酶类,如核酮糖二 磷酸羧化酶、ATP 合成酶、丙酮酸磷酸双激酶等均发 生了表达显著上调。在同为 ZD958 背景的 1#和 4#材料中,包括类萌发素蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶、PS Ⅱ的放氧增强蛋白的表达均发生了显著的升高;而在 同为 Z58 背景的 2#和 3#材料中,包括ATP合成酶、 放氧增强蛋白、类萌发素蛋白、肽基脯氨酰顺反式异构酶等蛋白的表达发生了显著升高。可以看出遗传背景相同的转基因玉米材料(1#和 4#、2#和 3#)在转入不同抗虫Bt基因后,其所引起的蛋白水平上的变化也 存在着一定的一致性。而不同遗传背景的转基因材料 (3#和 4#)转入相同抗虫 Bt 基因后,其蛋白水平上的表达变化则差异较大。














此外,对 4 份转基因材料获得的特异蛋白点与转基因材料中所转入的Bt蛋白序列进行比对,发现了特异蛋白点#3802、#4719、#3707、#3708分别对应Bt蛋白 cry1Ab、cry1Ie、mcry1Ac、mcry1Ac。说明转基因材料中转入的 Bt 基因在玉米中能够正常表达,并且这些 Bt 蛋白能够通过双向电泳被分离和鉴定,最终体现在蛋白质组分析所获得的特异蛋白点中。

2.2 差异蛋白的GO 分析和 KEGG 分析

虽然通过 BLASTx 对试验所得的差异蛋白点进行了初步鉴定,获得了蛋白信息,但这些蛋白在是否在细胞组成、生物途径和分子功能上具有共性,是否富 集于某一代谢途径,仍无法准确推断。通过对这些差异蛋白质的生物学功能和代谢通路富集分别进行 GO 和 KEGG 分析。发现转基因材料与对照材料相比虽有差异,但也主要集中在光合作用相关蛋白,并未发现特殊蛋白或特殊代谢途径的明显改变。SK12-5zd与ZD958比较发现,共有 5 个不同生 物途径的相关蛋白发生了差异表达,分别为光合作用 (photosynthesis)相关蛋白 3 个、还原型戊糖磷酸循环途径(reductive pentose-phosphate cycle)相关蛋白 2 个、钙离子结合(calcium ion binding)蛋白 2 个、不 同细胞组成相关蛋白 4 个(具体为膜外蛋白(extrinsic component of membrane)2 个和光合系统Ⅱ放氧复合体(photosystem Ⅱ oxygen evolving complex)相关蛋白2个。

Bt799zd与ZD958比较发现,有7个不同生物途 径相关蛋白发生了差异表达,分别为光合作用相关蛋白4 个,光呼吸(photorespiration)相关蛋白质2个和碳固定途径(carbon fixation)相关蛋白 2 个;发现 4 个不同分子功能的蛋白发生了差异表达,分别为 2 个核酮糖 -二磷酸羧化酶的活性蛋白( ribulosebisphosphate carboxylase activity)和 2 个单加氧酶活性蛋白(monooxygenase activity);按照细胞组成分析 也发现了 4 个蛋白发生了差异表达,分别为膜外蛋白 (extrinsic component of membrane)2 个和光合系统Ⅱ 放氧复合体(photosystem II oxygen evolving complex) 相关蛋白 2 个。

IE034z 与 Z58 比较发现,有 4 个不同生物途径相关蛋白发生了差异表达,均属于光合途径相关蛋白;有 5 个细胞组成相关蛋白发生了差异表达,分别为膜外蛋白3个和光合系统Ⅱ放氧复合体相关蛋白 2 个; 按照分子功能分析则发现了钙离子结合的蛋白发生了差异表达3个。 Bt799z与Z58比较发现,有4个生物途径相关蛋白发生了差异表达,均属于光合途径相关蛋白;按照 细胞组成分析有 6 个蛋白发生了差异表达,分别为膜外蛋白 3 个和光合系统Ⅱ放氧复合体相关蛋白 3 个; 还发现有 3 个分子功能为钙离子结合的蛋白发生了差异表达。

通过 2 倍上下调控表达水平来筛选转基因材料与其非转基因对照材料的差异蛋白质进行KEGG分析则发现,在 SK12-5zd与ZD958的比较中,差异蛋白在光合生物碳固定途径(carbon fixation in photosynthetic organisms)中显著富集;而在 Bt799zd 和 ZD958 的比 较中,差异蛋白则分别在光合生物碳固定途径、光合作用和碳代谢(carbon metabolism)几个代谢途径中显著富集。在 IE034z 和 Z58 以及 Bt799z 和 Z58 的比较中均为光合作用代谢途径中的差异蛋白显著富集(图4)。

3 讨论

随着转基因植物的研发和推广,转基因生物及其产品的分析鉴定,以及转入基因的直接表达产物和间接调控产物对转基因生物生长发育、生态环境、食物链及人类食品安全的影响越来越受到关注。由 于现有转基因生物中多数外源基因的表达或调控产 物都是蛋白质,因而在蛋白质水平上对转基因生物 进行评价显得尤为重要,蛋白质组学的兴起和发展 为在蛋白质水平上对转基因生物进行评价提供了可 能。

本研究对 4 种转基因抗虫玉米材料及其非转基因 对照玉米材料进行了蛋白质组分析。每份材料经双向 电泳凝胶分离后均可检测到 1 200 个蛋白质点,利用 PDQuest8.0 软件对蛋白质组表达谱进行分析,已检测到4份转基因材料与对照之间差异表达的 Bt 杀虫蛋 白,还鉴定出 61 个表达量发生显著变化的蛋白质点,主要集中于光合作用、同化物的积累及能量代谢过程。不同转基因材料中均检测到光合生物碳固定途径中的差异蛋白,如光合作用中决定碳同化速率的关键酶——核酮糖 1,5 二磷酸羧化酶、C4 植物光合作用途径中二氧化碳固定的关键酶——丙酮酸磷酸双激酶、放氧增强蛋白;植物中对逆境响应的类萌发素蛋白、以及 ATP 合成酶类等在 4 个转基因材料中均有显著的上调表达,这些差异蛋白不仅是遗传背景的差异,可能也与转基因玉米具有抗虫性 相关,而 GO 分析和 KEGG 分析的结果也证实了上述差异的存在。理论上光合作用的增强,生物体抗逆能力增强,生长会更健壮,植物的光合能力也会提高,这有待于后期对材料的观察和分析;同时光 合作用和碳固定过程增强,均涉及大量的能量物质流动,这些能量物质的去向与外源 Bt 蛋白的表达是否存在关联,有待深入分析。


本研究发现类萌发素蛋白在所有转基因材料中均有显著的上调表达,该蛋白是在植物中普遍存在的位于胞外基质的可溶性糖蛋白,绝大多数为稳定的低聚物,其作用为参与植物对逆境胁迫的响应。这类蛋白的上调表达可能预示着抗虫转基因玉米材料中,除依赖表达针对靶标生物的毒蛋白已达到抗虫的目的外, 还可能存在某种共有的变化机制,对其他逆境胁迫响 应产生作用,而具体作用机制需通过后续的逆境胁迫 响应评估及分析深入研究。

转基因作物的蛋白质组差异一方面是由于外源基因的插入造成的,另一方面还有可能由环境因素造成。本研究材料均在温室内培养至5叶1心期, 极大程度地避免了环境因素的影响,其结果所反应出的差异应主要为外源基因插入造成的蛋白质组差异。在此基础上,发现受体材料的遗传背景可能影响转基因材料的蛋白表达差异。本研究中所用的转基因自交系材料均是经过高世代选育获得的稳定材 料,其基因组差异极小,因此,在与其回交亲本材 料比较中所发现的蛋白质差异,应主要来源于外源基因的插入及表达所引起的蛋白质组变化。研究结果也证明在相同遗传背景的转基因材料中,其蛋白表达变化的一致性较高,而经过杂交配制的转基因杂交种材料,由于杂交过程中的不确定性,外源基因的表达和杂交过程均会对蛋白质组产生影响,因此导致检测出了更多的差异表达蛋白,本研究结果也再次证实了不同遗传背景但转入相同基因的材料 间(3#和 4#)其蛋白水平上的表达差异较大。这与抗虫玉米 Mon810 的相关蛋白质组的比较分析结果 基本一致,即在转基因玉米个体的蛋白质表达谱之间没有显著的个体差异,其主要差异源于基因组遗 传背景的差异。

抗虫转基因玉米生物安全评价过程中非常重视其食用和饲用安全性。综合分析本研究结果,在 4 份转基因玉米材料中并没有发现影响其食用或饲用安全的新蛋白,未发现植物生理、生化和代谢过程中发挥重要功能的蛋白质或致敏和毒素蛋白质产生或发生明显 的表达变化。由于蛋白质是具有生物功能的特殊大分子物质,转基因植物的食用安全性变化会直接体现在蛋白质水平上。本研究表明抗虫转基因玉米在蛋白质水平上并未产生可检出的影响其安全性的蛋白成分。 转基因材料中发生变化的蛋白多集中于光合作用、同化物的积累及能量代谢过程,这些过程也与转基因材安全性关系小,并非影响转基因材料安全性的非预 期效应。

4 结论

SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd 等4种转基 因抗虫玉米材料与对照蛋白质组相似性较高,仅有少数几个与光合作用、碳固定和 ATP 合成途径等基础代 谢过程相关基因出现上调表达,但未见基因的异常表达。测试的 4 种转基因材料在蛋白质水平未发生影响其安全性的非预期效应。

作者单位:哈尔滨师范大学生命科学与技术学院、吉林省农业科学院 

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来源:《中国农业科学》

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