中国科学家合作完成CRISPR-Cas13a介导的精确定点RNA编辑的人工机器

2018-06-13 | 作者: 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 | 标签: CRISPR

2018年5月 31日, 国际学术期刊《Nucleic Acids Research》在线发表了中科院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所李轩研究组合作完成的题为“Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing”的研究论文。该工作报导了一个利用新发现CRISPR家族中的Cas13蛋白(VI 型)、及其指导RNA(guide RNA)靶向结合特异序列单链RNA的能力,通过设计改造并与人源的RNA脱氨酶催化结构域(hADAR2d)结合,实现了精确定点RNA(A→I)编辑的人工机器。与近年来利用CRISPR家族蛋白(例如Cas9)对DNA编辑来修改基因/调控基因表达不同,Cas13体系不涉及编码基因DNA的改变,而是通过对基因转录产物(mRNA)进行编辑,为改变基因功能和调控表达提供了新的方法和思路。

近年来利用 CRISPR技术对生物物种基因DNA的编辑(包括切割和碱基替换),获得了巨大的成功,同时也面临技术上的限制。与DNA编辑技术互补,一个针对RNA的精确定点编辑技术,有独特的技术优势和应用。与DNA编辑技术相比,RNA的定点编辑不改变编码基因本身(DNA碱基改变后不能逆转),在时间上、空间上、和效率上更加可控。同时,RNA编辑可以同时修改多个基因、同时靶向多拷贝基因的所有转录产物(尤其是对多倍体的物种),所以更加高效。在对疾病的基因治疗领域,利用RNA定点编辑修复疾病组织的突变基因,有着重要的应用价值。

为了实现精确定点RNA编辑的人工机器,李轩研究组与杨晟研究员、中科院上海巴斯德研究所郝沛研究员、及美国密歇根大学王红兵教授合作,对新发现CRISPR家族中、具有结合特异序列单链RNA能力的Cas13a,首先在模式生物裂殖酵母(S pombe)中实现了其靶向内源RNA和降解靶标RNA的功能。进一步,设计利用Cas13a的改造产物dCas13a(丧失RNA切割活性的突变),将dCas13a与人源的RNA腺嘌呤脱氨酶催化结构域(hADAR2d)融合,引入到裂殖酵母中;再通过设计RNA编辑机器的靶向“零件”-指导RNA,实现了对内源RNA的精确定点编辑。为了对RNA定点编辑机器的设计和参数(编辑碱基位置、距离、指导RNA结构和长度等)进行优化,研究人员构建了一系列不同的设计,并利用一个双荧光报告(reporter)系统来测试不同设置的编辑效率,从而获得了精准RNA编辑机器的最优参数。优化后的编辑机器对内源靶标RNA的编辑效率达到了59%。最后,本研究实现的精准RNA编辑机器的功能,进一步体现在对裂殖酵母反转录转座子Tf1突变株的修复和操作的实验中。Tf1与动物细胞的逆转录病毒类似,其跳跃和扩增需要经过中间体RNA的逆转录步骤。研究人员利用精准RNA编辑,恢复了Tf1突变株的转座能力,这个应用对逆转录病毒干预和操作提供了一个有潜力的工具。

该研究主要由荆新云博士和研究生解冰冉、张牛冰等人完成。相关工作得到了中国农业部项目、国家科技重大专项、和自然科学基金项目的支持。

文章链接:academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gky433/5025895





Figure 1. Implementation of the LshCas13a system in fission yeast



Figure 2. Construction and validation of the dCas13a-mediated system for site-specific editing ofmRNA for a fluorescent reporter
 

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来源:中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所

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