生物强化新思路:虾青素水稻

2019-01-15 | 作者: 朱丽 钱前 | 标签: 虾青素

氧化胁迫是生物体内最常见的一种胁迫现象。生理状态下,细胞利用其内部复杂的调控网络,清除生物体产生的有毒和有害副产品,保持代谢平衡。但当外部环境胁迫加剧或细胞内部出现衰老等情况时,代谢毒副产品与清除物间的平衡被打破,毒副产品积累进而导致细胞毒性。活性氧(ROS)/活性氮(RNS)与生物体抗氧化防御系统间的不平衡是产生氧化胁迫/氧化应激的主要原因。ROS在细胞中的积累会造成DNA、蛋白质及脂质的损伤,并进一步损害组织和器官。作为高耗氧组织的人类大脑,富含各种脂类物质,对氧化胁迫尤为敏感。近年来,越来越多的研究表明,人体中的氧化应激反应与众多衰老及中枢神经性疾病的发生密切相关,如帕金森综合症、慢性进行性舞蹈病及阿尔茨海默病等。

因此,如何提高机体细胞内源的抗氧化能力,已日益成为预防和治疗这类疾病的新的研究方向。类胡萝卜素作为一种天然的植物源四萜类化合物,除可使植物呈现不同的颜色外,还具有抗氧化特性。脂溶性类酮胡萝卜素——虾青素(学名3,3′-二羟基-4,4′-二酮基β-胡萝卜素),比其它类胡萝卜素或维生素E具有更强的抗氧化活性,可延缓衰老、提高免疫力、防治糖尿病和心血管疾病等,已广泛用于制药、营养品、化妆品和水产养殖等行业。

自然界中,虾青素仅在一些微藻、细菌和酵母中合成,大多数高等植物和动物中未见存在。部分海洋生物(如虾类、贝类、鲑鱼和鳟鱼等)通过吞食这些微藻和细菌在体内积累虾青素,人类则主要从这些海洋食物中摄取(或提取)虾青素。因此,利用高等植物尤其是重要农作物合成虾青素是生物强化工程的极佳策略。

已有很多关于天然植物如枸杞(富含枸杞多糖、枸杞色素、类黄酮及甜菜碱等)、山楂(富含熊果酸、皂苷、有机酸、色素及黄酮类物质等)和山药(富含山药多糖和皂苷类物质等),所含有效成分在人体抗氧化、抗衰老及缓解衰老相关疾病等方面作用的报道。但是这些动植物资源绝大部分来自自然进化,所含成分复杂且有效成分占比少,如果大量食用,非有效成分产生副作用的可能性较大。

因此,开发新的有效成分占比高且特异性好的功能型、营养型食材已成为研究热点。生物强化是指通过常规育种或基因工程手段在作物中增加微量营养素或植物营养素。事实证明,这种方法可极大地改善人类营养状况和促进身体健康。经过多年的努力,科研人员目前已开发出一系列富含营养素的生物强化作物,如富含胡萝卜素的金米2号、富含叶酸的水稻、富含维生素B6的木薯和富含花青素的紫晶米等。这些功能性作物的开发和利用将有助于提高人类的健康水平。

虾青素是一种红色的类酮胡萝卜素,其抗氧化活性是维生素E的550倍,由β-胡萝卜素羟化酶(BHY)和β-胡萝卜素酮化酶(BKT)催化合成。BHY基因在高等植物中广泛存在而BKT基因则仅存在于部分微藻、细菌和酵母中,大多数高等动、植物中都没有该基因,因此无法产生酮类胡萝卜素。水稻作为世界上最重要的粮食作物,是全世界近1/2(我国2/3)人口的主粮。然而稻米中缺乏类胡萝卜素前体无法自主合成虾青素,而且多年来在水稻中人工合成虾青素的尝试均未获得成功。多个基因反复转化或多个转基因材料杂交,都可以达到多基因垛叠表达的效果,但前者受制于选择标记的匮乏,后者则需要更长的研究周期。利用多基因串联的单载体转化、2个或2个以上载体共转化同一受体细胞的方法虽然可以解决这些问题,但受限于载体容量和表达效率,5个以上基因的表达一直是多基因转化和表达的瓶颈。

2017年,华南农业大学刘耀光研究团队首次利用自创的TGSII系统,成功在水稻胚乳中表达了8个花青素合成及调控相关的外源基因,突破了多基因转化的技术壁垒,获得了无标记且胚乳高效合成花青素的水稻新种质。在此基础上,2018年刘耀光研究团队再次利用TGSII系统,成功在水稻胚乳中表达了4个虾青素合成相关的外源基因,创制了无选择标记且胚乳高效合成虾青素的功能米。

类胡萝卜素/酮类胡萝卜素/虾青素的生物合成受多基因控制,不同的基因在合成过程中各司其职,缺一不可,但参与这一过程的基因以及各基因编码蛋白的分工均不明确。Bai等(2017)在水稻中共转化PSY(八氢番茄红素合酶)、CrtI(八氢番茄红素脱氢酶)和BKT三个基因,但并未获得虾青素积累的转基因水稻。因此,要获得虾青素积累的水稻,明确其生物合成机制是关键。为此,研究人员通过转基因方法,系统分析和总结了类胡萝卜素/酮类胡萝卜素/虾青素的生物合成途径,明确了合成途径中必需的基因及其编码蛋白的各自分工。

水稻有不同的组织器官,如根、茎、叶、鞘和穗,而我们仅食用稻米的胚乳部分。如何使外源基因特异地在胚乳中表达并在其中积累虾青素是需要解决的又一个难题。Sato等(2013)通过分析公共转录组数据,发现水稻胚乳内源类胡萝卜素合成基因(包括OsBHY)发生了沉默或表达水平极低,因此无法自主合成类胡萝卜素前体。成功培育富含β-胡萝卜素的金稻2号,为胚乳中积累虾青素解决了前体合成问题。基于此,研究人员推测,水稻胚乳中虾青素的有效生物合成可能需要引进和表达BKT、BHY、PSY及CrtI基因。通过密码子优化,他们分别合成了玉米的sZmPSY1、菠萝泛菌的sPaCrtI、莱茵衣藻的sCrBKT和雨生红球藻的sHpBHY基因。由于类胡萝卜素合成的中间产物以及最终产物均在质体中合成,研究人员又在这些合成基因编码蛋白质氨基酸序列的N端融合了豌豆Rubisco小亚基的质体转运肽序列。利用水稻球蛋白基因Glb1以及水稻谷蛋白基因GluB4、GluC和GluB1中胚乳特异性启动子分别与sZmPSY1、sPaCrtI、sCrBKT和sHpBHY构建了4个供体载体表达盒,通过TGSII系统的组装,最终获得了多基因表达载体pYLTAC380MF-BhBkPC,它可以携带4个虾青素合成基因(转化株系AR系)。同时,研究人员还制备了2个对照载体,即包含sZmPSY1和sPaCrtI基因的pYLTAC380MF-PC载体(转化株系GR系)以及包含sZmPSY1、sPaCrtI和sCrBKT基因的pYLTAC380MF-BkPC载体(转化株系CR系)。pYLTAC380MF-PC载体的转化预计可以获得类似金米2号的黄金米,而pYLTAC380-MF-BkPC载体的转化可以检测在缺失BHY基因的条件下,水稻胚乳内源OsBHY的表达量是否足以支撑虾青素的合成。如果内源OsBHY的表达量不足,pYLTAC380MF-BkPC转化的稻米中则仅有角黄素合成。利用农杆菌介导法将这些载体分别转化籼稻品种华光1号,转基因株系分析表明,AR系中均富集了虾青素,稻米呈晶莹剔透的红色,故又称“赤晶米”,GR系获得了类似金稻2号的黄金米,CR系则富含角黄素。

PCR分析证实,外源基因在不同世代的转基因水稻中稳定遗传,且CRE/LoxP功能正常。对筛选标记进行精准切除,确保所有转基因阳性株中均不含筛选标记。除籽粒颜色外,虾青素转基因植株的其它农艺性状并未发生改变。后续,研究人员通过高效液相色谱法和定量分析法进一步测定了不同转基因系中β-胡萝卜素、角黄素及虾青素的成分及含量,发现AR-H8株系中虾青素的含量最高(16.23μg·g–1DW),约占类胡萝卜素总量(21.94μg·g–1DW)的74%。GR-H1株系中富集的β-胡萝卜素为24.73μg·g–1DW,约占类胡萝卜素总量(27.56μg·g–1DW)的80%,与金稻2号中的含量相近。而CR-H2株系中富集的角黄素为25.8μg·g–1DW,占类胡萝卜素总量(31.4μg·g–1DW)的82%,远高于Bai等(2017)获得的转基因株系。由于AR系中虾青素/类胡萝卜素的比值达0.60–0.74,证明sHpBHY的活性不是虾青素生物合成的限制因素。此外,研究者推断,在现有基因基础上,通过增加表达上游2C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)通路的一些关键基因,如1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合成酶编码基因DXS和八氢番茄红素合成调控基因OR,将有助于进一步促进转基因水稻中虾青素的积累。虾青素的主要作用是抗氧化,因此研究人员利用氧自由基吸收能力测定法测定了不同转基因株系的抗氧化能力。结果表明,AR系在3种转基因株系中的抗氧化能力最强,GR系与CR系差别不大,CR系略低。AR系中虾青素的抗氧化能力高于其它类型的类胡萝卜素。袁超和金征宇(2010)研究表明,在加热的条件下,虾青素的分解温度为250°C。

因此,AR系稻米中的虾青素并不会因蒸煮造成降解和失活。虾青素功能米不仅可作为日常的保健膳食,还可用于浓缩和提取虾青素,在食品、制药、饲料和日化等领域具有广阔的应用前景。

另外,一系列的实验还证明,胚乳特异性启动子驱动下的2个(sZmPSY1和sPaCrtI)、3个(sZmPSY1、sPaCrtI和sCrBKT)或4个(sZmPSY1、sPaCrtI、sCrBKT和sHpBHY)基因表达盒,可以在水稻胚乳中稳定构建类胡萝卜素/酮类胡萝卜素/虾青素的生物合成途径。同时也证明了至少有4种基因(sZmPSY1、sPaCrtI、sCrBKT和sHpBHY)参与虾青素的生物合成。这一研究不仅是多基因转化技术体系的进一步完善,也是虾青素在水稻胚乳中从头合成技术壁垒的首次突破。

通过该项研究,刘耀光研究团队分别获得了富含β-胡萝卜素的黄金米、富含角黄素的角黄素米和富含虾青素的赤晶米,实现了从前体、中间产物到终产物的精准合成,为更多功能性稻米的开发提供了新思路和重要依据,也为合成生物学中复杂代谢工程的解析及植物多基因调控农艺性状的改良提供了有益参考。

原文:朱丽, 钱前(2019).虾青素功能米: 生物强化新思路,优质米培育新资源. 植物学报 54, 1–1. 有改动。

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来源:植物学报

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